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石化廢水是石化工業在生產各種石油產品和有機化工材料過程中產生的廢水. 石化廢水污染物種類多、 成分復雜、 水質水量波動大. 廢水中含有石油類、 苯和苯的衍生物等多種毒性有機物，屬于難降解的工業廢水[1]. 單一的處理工藝很難達到要求，常采用物化法預處理，厭氧/好氧生化法二級處理，有些石化企業為達到更高的排放標準或實現回用還設有深度處理工藝[2, 3]. 其主體工藝為以活性污泥法、 缺氧/好氧(A/O)、 生物流化床等為代表的二級生化處理工藝[4].

　　A/O工藝具有較高的有機物降解和脫氮能力，并且基建和運行費用低，近年來在國內外發展迅速. 溶解氧是O段需要控制的重要指標. 曝氣費用一般占污水運行費用的60%~80%，溶解氧過高會造成能量的浪費，而且影響總氮的去除[5]. 較低的溶解氧會抑制好氧菌的活性，影響有機物的降解和硝化作用[6]. 吳昌永等[7]研究采用A2/O工藝處理生活污水，當O段溶解氧(DO)濃度從4.0 mg ·L-1降到1.0 mg ·L-1時，COD的去除率一直保持在較高的水平，但系統硝化效果降低. Guo等[8]研究表明較低的DO水平(1.5~2.4 mg ·L-1)有利于A/O生物膜反應器的快速啟動，而且抗沖擊負荷能力強.

　　目前關于DO影響的研究大多針對生活污水，對處理實際石化廢水的研究十分有限; 并且缺乏DO對反應器微生物群落結構和代謝機制的影響研究. 傳統的分子生物學方法操作繁瑣復雜，得到的信息量有限. Rocher 454測序[9]是一種基于焦磷酸測序原理的高通量基因組測序技術，具有測序速度快、 讀長長、 通量高、 準確度高和一致性好等優點. 它不僅可以獲得樣品中的微生物群落組成，并將其含量進行數字化，而且可進行種群多樣性和豐度分析[10].

　　本文以實際石化廢水為處理對象，研究DO濃度對A/O反應器降解有機物和脫氮除磷效果的影響; 并解析不同DO濃度下微生物的群落特征，以期為A/O工藝運行調控提供技術基礎.

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗裝置

　　實驗裝置如圖 1所示. 廢水經蠕動泵進入A/O反應器，出水經沉淀池沉降后從頂部溢流堰排出，沉淀池底部的污泥經蠕動泵回流至缺氧A段. 反應器由有機玻璃制成，分為平行運行的A、 B兩組. 每組由一個A段和兩個好氧段O1、 O2組成，總體積為45 L，A段、 O1段和O2段的比例為1 ∶2 ∶2，沉淀池體積為28 L. 反應器在A段設有機械攪拌，O段采用底部砂棒曝氣. A組反應器O段的DO控制在2~3 mg ·L-1，B組反應器控制在5~6 mg ·L-1，反應器溫度為23~26℃.


　　圖 1 實驗裝置示意

　　1.2 實驗用水和啟動、 運行方案

　　實驗裝置建在我國北方某石化綜合污水處理廠內. 該污水廠的進水由工業廢水和生活污水兩部分構成，比例約為3 ∶1. 工業廢水來源于該公司下屬的煉油廠、 化肥廠、 電石廠、 樹脂廠等所有化工廠處理后的出水. 實驗用水取自該污水廠的水解酸化池出水，水質指標如表 1所示. 進水COD波動較大，總氮(TN)主要以氨氮為主，總磷(TP)含量比較低.


　　表 1 實驗廢水水質 1)

　　接種污泥取自該污水廠的曝氣池. 反應器自2013年4月24日啟動，悶曝48 h后開始連續進水. 水力停留時間(HRT)為30 h，回流比為100%. 經過兩周左右的馴化，出水水質穩定，COD去除率達到70%以上，反應器啟動成功. 反應器穩定運行分兩個階段：自2013月5月20日至2013年9月4日，HRT為30 h; 自2013年9月5日至2013年11月6日，HRT為20 h. 污泥齡(SRT)為50 d.

　　定期(每隔2~3 d)取樣測定反應器進水、 出水的COD和氨氮濃度. 不定期檢測進、 出水BOD5、 TN、 TP濃度和反應器各段COD和氮化合物的濃度分布. 所有水樣均采用0.45 μm濾膜過濾后再進行分析. 反應器運行穩定后，取兩組O段污泥樣品進行微生物種群結構解析. 對反應器進、 出水進行溶解性微生物產物(SMP)、 蛋白質、 多糖和腐殖酸含量以及3D-EEM熒光光譜檢測分析其水質特性的變化規律.

　　1.3 分析方法

　　BOD5、 COD、 氨氮、 硝氮、 亞硝氮和總磷測定均參照國標方法測定[11]. 總有機碳(TOC)和TN使用總有機碳分析儀(TOC-VCPH/CPN,島津)測定. 多糖測定采用苯酚硫酸法，蛋白采用考馬斯亮藍法. 污泥濃度(MLSS)采用重量法測定. DO和水溫采用便攜式溶解氧測定儀(YSI-550A). 采用3D-EEM熒光光度計(Hitachi F-7000)分析出水溶解性有機物質的組成[12]，激發波長(Ex)為200~400 nm，發射波長(Em)為240~500 nm，狹縫寬度5 nm，掃描速度1 200 nm ·min-1，光電倍增管PMT電壓700 V.

　　微生物種群分析采用454高通量測序法，具體實驗方法如下.

　　1.3.1 DNA提取與純化

　　生物膜樣品的DNA采用E.Z.N.A.土壤DNA提取試劑盒(OMEGA公司)進行提取，實驗按照生產廠商提供的方法進行.

　　1.3.2 PCR擴增

　　DNA樣品采用16S rRNA通用引物(27F和533R)對細菌的V1～V3區域進行擴增. 前向引物(5′-GCC TTG CCA GCC CGC TCA GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3′)包含454B銜接子序列和細菌通用引物27F序列. 反向引物(5′-GCC TCC CTC GCG CCA TCA GNN NNN NNN NNT TAC CGC GGC TGC TGG CAC-3′)包含454A銜接子序列，隨機組合的10個堿基標記每一種PCR產物和細菌通用引物533R序列. PCR反應于20 μL體系中進行，包含0.4 μmol ·L-1正向和反向引物，1 μL模板DNA，200 nmol ·L-1 dNTP和1×FastPfu Buffer. 以不含DNA的PCR水來稀釋. PCR反應程序設定為：94℃預變性2 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25個循環，最終72℃延伸5 min. 擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測. 擴增產物以AxyPrepTM凝膠回收試劑盒回收(AXYGEN公司).

　　1.3.3 擴增產物檢測、 焦磷酸測序

　　擴增產物DNA濃度用Quant-iT PicoGreen dsDNA試劑盒測定(Invitrogen公司)，DNA樣品以30 μL TE緩沖液稀釋，在微細胞比色皿加入等量2X PicoGreen工作溶液，總反應體積60 μL. 以465~485 nm為激發波長，515~575 nm為發射波長，采用Turner Biosystems TBS-380熒光光度計測定其熒光強度. 濃度定量測定后，純化后的DNA，等摩爾比例加入到試管中. 焦磷酸測序采用454 GS FLX Titanium測序方法(羅氏)，由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行. 在0.03水平進行OTU聚類和物種分類分析. 以MOTHUR軟件以及序列聚類軟件Usearch4.0.38進行序列比較及分析. 所比對的數據庫為Silva106 版.

　　2 結果與討論

　　2.1 DO對A/O反應器去除有機物和氮磷的影響

　　A/O反應器啟動成功后穩定運行近半年的時間. A、 B兩組反應器內的A段和O的污泥濃度(MLSS)分別保持在3~4 g ·L-1和5~6 g ·L-1，MLVSS/MLSS的比值在71%~75%，污泥活性均較高. 圖 2和圖 3分別為進、 出水COD和氨氮濃度及其去除率隨時間的變化. 兩個HRT下，A、 B兩組反應器出水的水質指標列于表 2. 可以看出，盡管進水的COD濃度波動較大，但COD的去除率保持穩定，A/O反應器具有良好的抗沖擊性. 出水的BOD5均低于5 mg ·L-1，說明A/O反應器對有機物的生物降解比較徹底. HRT為20 h時出水COD的去除效果優于30 h. 在HRT為20 h時，A組反應器出水的COD(72.5 mg ·L-1±14.8 mg ·L-1)略高于B組反應器出水(68.7 mg ·L-1±14.6 mg ·L-1)，COD平均去除率分別為67.0%和68.8%，TOC的去除率分別為64.4%和69.1%. 說明低DO濃度下運行對有機物的去除沒有顯著影響.


　　表 2 A、 B反應器出水指標分析


　　圖 2 進、 出水COD濃度及其去除率隨時間變化


　　圖 3 進、 出水氨氮濃度及其去除率隨時間變化

　　反應器運行初期，低DO運行的A組反應器出水的氨氮濃度較高，說明硝化菌的活性降低. 但經過3個月的運行后，兩組反應器出水的氨氮濃度已經沒有顯著差別，氨氮的去除率均在90%以上.

　　2.2 反應器各段有機物和氮磷去除效率分析

　　A、 B反應器各段COD、 NH+4-N、 TN和TP的濃度變化如圖 4所示. A、 B反應器的降解趨勢基本一致. 考慮到100%硝化液回流到A段，COD和氨氮在A段大約被稀釋了一倍. COD和氨氮的降解主要發生在O段. 有機物在O段基本完成降解，二沉池污泥絮凝沉降過程中，也會吸附一部分有機物，使COD濃度進一步降低.

　　氨氮在O段發生硝化作用轉化為硝態氮，硝態氮在A段發生反硝化作用轉變為氮氣，因此TN的去除主要發生在A段. O段也有一定的去除作用，說明在O段也有一定數量的反硝化菌. A組反應器TN的去除率(31%)略高于B組(26%)，B組反應器O段的高溶解氧回流會影響A段的反硝化效果，從而影響TN的去除. 反應器出水的TN以硝態氮為主，亞硝態氮一直保持在非常低的水平(小于0.07 mg ·L-1)，表明硝化反應進行得較為完全. 出水硝態氮的增加主要來自氨氮和有機氮的轉化.


　　對于TN，左側柱狀圖為反應器A，右側為反應器B

　　圖 4 A、 B反應器沿程COD、 NH4-N、 TN和TP濃度變化

　　A/O反應器對于總磷的去除通過厭氧釋磷、 好氧吸磷最終排泥而去除. B組反應器TP的去除率略高于A組，分別為39%和34%，說明聚磷菌的活性均較強. 出水總磷濃度低于1.0 mg ·L-1，達到《城鎮污水處理廠污染物排放標準》一級標準.

　　2.3 A/O反應器進、 出水溶解性有機物質組成分析

　　SMP是由于基質代謝(通常與生長相關)和污泥衰減釋放的一類有機化合物，對于生化處理污水的出水水質和處理效率有重要影響，其主要成分為腐殖酸，多糖和蛋白質[13]. 進水中SMP所占COD的質量分數為30%左右，出水SMP對COD的貢獻增至70%~75%. 進水及A、 B反應器出水SMP各組分的濃度變化如圖 5所示. 多糖和蛋白質的降解主要依靠微生物自身的代謝，而腐殖酸幾乎不能被微生物利用，只能依靠排泥去除. 蛋白質最容易被微生物利用，其次是多糖，去除率分別為61.3%和48.9%，腐殖酸的去除率只有16.5%. A、 B反應器對蛋白質和腐殖酸的去除效率基本相同，低DO運行的A反應器對多糖的降解效率比B反應器高20%左右.


　　圖 5 進、 出水SMP各組分的變化

　　對反應器進出水進行3D-EEM掃描，結果表明進水中主要有3個峰，分別對應為酪氨酸類物質、 色氨酸類物質和SMP類物質[14]. 經過A/O反應器處理后，色氨酸類物質的峰基本消失，水中主要為酪氨酸和SMP物質，峰的強度較進水均顯著減小，表明這些物質已被生物降解. A反應器出水峰的強度略高于B反應器出水.

　　2.4 不同DO條件下反應器O段污泥微生物種群結構解析

　　表 3為A、 B反應器O段污泥樣品的454測序結果. 其中豐富度指數Ace和Chao1是估計群落中含有OUT數目的指數，生態學中常用來估計物種總數. 多樣性指數Shannon和Simpson用來估計群落中OUT多樣性高低的群落多樣性指數. Shannon 值越大，Simpson越小，說明群落多樣性越高. 從表 3數據可以看出，高DO運行的反應器B具有較高的菌群豐度和多樣性，表明較高的DO濃度有利于好氧菌的生長和繁殖.


　　表 3 細菌種群多樣性指數特征 1)

　　在門的水平，兩個反應器O段污泥細菌種群分布如圖 6所示. 主要優勢菌群依次為變形菌門 (Proteobacteria)、 浮霉菌門 (Planctomycetes)、 擬桿菌門 (Bacteroidetes)、 綠彎菌門 (Chloroflexi)、 酸桿菌門 (Acidobacteria)、 放線菌門(Actinobacterium)、 藍藻門(Cyanobacteria)、 綠菌門(Chlorobi)、 厚壁菌門(Firmicutes)、 芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae). 變形菌門、 浮霉菌門和擬桿菌門菌群所占比重較大，在A、 B反應器中的比例分別為58.7%和59.2%、 14.7%和12.7%以及10.8%和12.4%，總和加起來接近85%. A、 B兩個反應器比較，低DO運行的A反應器浮霉菌門、 厚壁菌門和芽單胞菌門細菌比例高于B反應器; 高DO運行的B反應器中擬桿菌門、 放線菌門、 綠菌門和硝化螺旋菌門細菌所占的比例高于A反應器. 污泥中的優勢菌群變形菌門是細菌中最大的一門，包括很多好氧、 厭氧或兼性細菌，具有多種代謝種類，也有一些無機化能種類(如可以氧化氨氮的亞硝化單胞菌屬Nitrosomonas)，能夠在降解有機物的同時完成脫氮除磷功能. 浮霉菌門是一小門水生細菌，在海水和淡水中都可被發現. 擬桿菌門菌群常在除磷系統中被報道，可降解蛋白質、 糖類等物質[15, 16].


　　僅列出大于0.5%的數據

　　圖 6 在門的水平上，A、 B反應器污泥細菌菌群的相對豐度

　　在屬的水平鑒定出的主要優勢菌及其豐度如表 4所示. 可以看出，較高的DO有利于硝化作用，反應器中B中氨氧化菌Nitrosomonas和亞硝酸氧化菌Nitrospira的比例較高. 一些專性好氧菌如Planctomyces的豐度高. 一些厭氧反硝化菌如Azospira和Acidovorax[17]以及聚糖菌Defluviicoccus在A反應器中的含量較高. 值得一提的是，有報道指出，鑒定出的Novosphingobium屬、 Comamonas屬、 Sphingobium屬和Altererythrobacter屬細菌具有降解多種多環芳烴、 氯代硝基苯、 農藥和石油化合物的功能[18, 19, 20]，有利于石化廢水的降解.

　　表 4 在屬的水平鑒定出的主要優勢菌及其豐度

　　3 結論

　　(1)盡管石化廢水的進水COD濃度波動較大，但A/O反應器出水COD的去除率保持穩定. 在HRT為20 h時，A組反應器出水的COD(72.5 mg ·L-1±14.8 mg ·L-1)略高于B組出水(68.7 mg ·L-1±14.6 mg ·L-1)，COD平均去除率分別為67.0%和68.8%; 出水氨氮的平均濃度和去除率均為0.8 mg ·L-1和95%. 這表明DO在2~6 mg ·L-1范圍內，DO濃度對有機物和氨氮的降解沒有顯著影響. 系統保持在低DO(2~3 mg ·L-1)運行可以大大減少曝氣費用.

　　(2)A、 B反應器TN和TP的去除率分別為30%和26%，34%和39%. 進水主要為酪氨酸類、 色氨酸類和SMP類物質，A/O反應器出水主要為酪氨酸和SMP類物質，峰的強度較進水均顯著減小.

　　(3)對O段污泥進行454高通量測序結果表明：優勢菌群為變形菌門、 浮霉菌門和擬桿菌門菌群. 高DO運行的反應器B具有較高的菌群豐度和多樣性，氨氧化菌Nitrosomonas和亞硝酸氧化菌Nitrospira的比例較高. 一些厭氧反硝化菌如Azospira和Acidovorax在A反應器中的豐度較高. 兩個反應器均檢測出具有降解多種多環芳烴、 氯代硝基苯、 農藥和石油化合物功能的Novosphingobium屬、 Comamonas屬、 Sphingobium屬和Altererythrobacter屬細菌.